Inga sexiga email här inte

Man skulle kunna tänka sig att man skriver romantiska, söta mysiga och/eller sexiga email till sin make när han befinner sig på andra sidan Atlanten sedan ett par dagar tillbaks. Särskilt som det faktiskt fortfarande är nästan en vecka kvar innan han ska komma tillbaks. Och speciellt eftersom jag faktiskt saknar honom mycket och längtar efter honom. Mycket.

Men, detta var dagens email till M (något förkortat).

Eh, märks det att jag saknar honom...???

(Obs! Det är heeelt okej att scrolla igenom nedanstående email lite snabbt!!)

"Hej Puss!

Du hoppas du inte är superarg på mig för att jag fuckade up det där med pengarna!!! Fasiken! Jag grämer mig.... Hm... Jaja, som du säger så är det inte mycket att göra åt saken. Jag tar det på mig. Sorry!!!!!!!!!!

Tror jag är lite full i skallen nu. Framförallt av jobbet...

Min kloning vill bara inte funka. Nu har jag screenat ca 300 kolonier och ingen har insert utom den jag hittade när ni åkte, men som visade sig vara felvänd. Tänker som satan på detta. Och då har jag ändå börjat att ENBART fokusera på EN av alla de ligeringar jag ska göra... Suck! Jaja. Nu har jag ett par strategier jag funderar på. Kan du kolla dessa och se ifall jag tänker hyfsat sansat?

1) Den ligering som fungerat (men som är felorienterad) KAN jag ju klyva igen MEN eftersom ena NruI sitet uppenbarligen pajat (fattar inte alls hur det gick till?!?!?!?!) så kan jag inte bara klyva med NruI utan måste klyva med NruI + SacII. Det senare enzymet klyver strax efter NruI (ca 60 bp efter). Jag har kollat och jag måste göra seqential digest eftersom de klyver i helt olika buffert. Den ena i Neb3 och den andra i Neb4. Visst ska man klyva i buffer med lägst salthalt först?! När jag kollar buffertarna har den ena 100mM NaCl och resten är 10-50mM av olika salter i bägge buffertarna. Så då ska jag väl klyva m enzymet som kräver den buffer med 100mM sist???

Ska man precipitera DNAt mellan klyvningarna eller räcker det med att inaktivera enzym 1???? Eller måste jag kanske t o m gelrena eller Pheno-Chloro-rena DNAt innan jag kan klyva m enzym 2???

Tänkte iallafall att jag skulle kunna klyva ut insertet m dessa två enzym och sedan blunta med Klenow så att jag får två blunt ends. Fungerar Klenow på alla enzym?

SacII klyver och ger 5´ CCGC GG 3´

3´ GGC GCC 5´

Sedan tänkte jag iallafall att jag skulle återligera alltsammans. Kanske fungerar det kanske inte, men det kan ev vara värt ett försök?

2) Parallellt med detta funderar jag på att subklona in insertet i en invitrogen vector. Brukar du använda TopoTA cloning vectors? Jag har ju hittat en som heter Zero Blunt PCR cloning Kit (Invitrogen cat# 2700-20) och som vi har i labbet. Man ska ligera in sin PCR produkt i vektorn och sedan kan man klyva ut det med EcoRI. Fast i mitt fall kommer jag inte kunna öppna min vektor med EcoRI efersom detta enzym klyver på fler ställen. Utan jag gissar att jag antingen får kolla upp resten av enzymen som finns i multicloning sequence i Invitrogen-vektorn och se om jag kan använda ngt av dem, annars får jag köra Klenow igen för att blunta antar jag???

Men KAN detta steg ändå göra det enklare?? Och på vilket sätt då jämfört med PCR-ligering direkt? Får jag mer DNA? Eller varför skulle det vara bättre att göra såhär?? Är det för att det är bättre att använda direktklyvt DNA framför att CIPa eller APa det????? För gelrena mitt insert måste jag väl i vilket fall som helst?

3) Funderar även på detta med polylinkers. Hur fungerar det egentligen? Ska jag isåfall designa oligos med NruI site i båda ändar och som sedan innehåller de restr enzym sites som jag skulle vilja använda när jag ska ligera in mitt insert? Jag är säkert hur dum i huvudet som helst men vad ska jag använda för templat????? För hur ska jag amplifiera dessa oligos så att jag kan ligera in dem i min vektor?

Och isåfall måste jag väl sedan göra nya primers för mitt insert också med just rätt sites i både 5´- resp 3´- änden? Som jag så småningom ska kunna ligera ihop med min vektor + polylinkers....?

Jag har funderat lite på Emilys förslag också, men jag tror det är otänkbart för det kommer bli superlånga oligos och det blir alldeles för dyrt!!! Annars hade det såklart varit jättebra!

Ah, jag tror jag blir helt snurrig av alla dessa funderingar hit o dit.... Men det vore super ifall du har tid att titta igenom mina snurriga tankar och se ifall de verkar genomförbara och även om du kan svara på mina frågor. Jag tror att jag ibland blir extra snurrig av att försöka fundera på flera saker samtidigt!!!" *)

Visst är det ett otroligt kärleksfullt email?

Jag avslutade dock mailet med att berätta hur mycket jag saknar både honom och Lill-Skruttan. Så heeeelt känslokallt var det inte.

Jaja. Detta visar ändå kanske lite av vad som snurrar runt i mitt huvud just nu. det är ett getingbo därinne av surrande tankar. Kanske är detta en av orsakerna till att jag lyckades klanta till det rent otroligt igår med presenterna till lärarna. Som sagt, ingen ursäkt men kanske kanske en förklaring....?

Nu har jag iallafall just avslutat en jättetrevlig kväll här hemma med några vänner från mitt gamla jobb. Vi har grillat på vår bakgård och sedan suttit och tjattrat här hemma. Jätteroligt och mysigt. Det blev dock lite manfall eftersom de två från mitt nya jobb som skulle kommit fick förhinder i sista minuten. En av dem kom en stund iallafall och det var trevligt.

Imorgon är det planerat att vi ska ut med nya jobbet och fira en av kollegornas förlovning. Just nu börjar jag dock nästan känna mig lite sliten så vi får se ifall jag orkar hänga med. Som det känns nu följer jag troligen med till första stället och skålar med dem, men kanske inte till den thairestaurang som är nästa anhalt. Känner faktiskt mest för att ha en skön hemmakväll i lugn och ro. Vi får se hur det känns imorgon.

Nu är det sängen som lockar.

Men sist en länk till M´s mosters blogg samt Svägerskans där "Dagens Lillskrutta" kan avnjutas.

*) Ber om ursäkt för att mailet för en utomstående kan verka helt galet konstigt. Men det är helt enkelt problem på jobbet som jag hoppas att M ska kunna hjälpa mig att lösa eller iallafall ge mig lite input om.

**) IFALL det är någon därute som råkar läsa detta inlägg och som är bra på "blunt end cloning" får ni mer än gärna höra av er med tips och råd!! Tack!